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液氮超低溫保存技術(shù)在果樹種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用

時間:2020-08-12 08:41來源: 作者:班德液氮罐 點(diǎn)擊:
目前,世界上的植物遺傳基礎(chǔ)趨向單一化,一些地方品種及珍貴稀有的作物資源也從地球上逐漸消失。因此世界各國對種質(zhì)資源的收集和保存都非常重視,近幾十年來,液氮超低溫保存技術(shù)發(fā)展迅速,為種質(zhì)資源的保存開辟了新的途徑。液氮罐

1 液氮超低溫保存技術(shù)原理及優(yōu)點(diǎn)

通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫。超低溫冷凍保存一般以液態(tài)氮為冷源,使保存溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下,新陳代謝活動基本停止,處于"生機(jī)停頓"(Suspanded animation)狀態(tài)。這就有可能極大地延長儲存材料的壽命,而不產(chǎn)生遺傳變異,從而有效地、安全地長期保存那些珍貴稀有的種質(zhì)。 利用液態(tài)氮保存植物種質(zhì),液氮冷凍容器就是液氮罐。除了1~2個月補(bǔ)充一次液氮外,不需要機(jī)械空調(diào)設(shè)備及其它管理,節(jié)省了大量的人力和物力。并且可以保持被保存組織及細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性。因此比其它保存方法有著很大的優(yōu)點(diǎn)。

2 基本程序

2.1 材料的準(zhǔn)備與選擇

超低溫保存的材料一般選擇處在指數(shù)增長的細(xì)胞材料。如愈傷組織的超低溫保存一般選擇培養(yǎng)18~24d的培養(yǎng)物作為材料。

2.2 預(yù)處理

使保存材料達(dá)到適合于超低溫保存的生理狀態(tài)。主要是提高分裂相細(xì)胞的比例的減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量。

2.3 放入冰浴

將材料裝入試管或其他保存容器中,并隨既插入冰浴中。

2.4 加入保護(hù)劑

加入0℃預(yù)冷冰凍保護(hù)劑,在0℃冰浴中放團(tuán)置30~45min。

2.5 降溫冰凍

(1)直接投入液氮。

(2)程序慢速0.05~5℃/min降溫到投入液氮。

(3)慢速降溫到預(yù)凍溫度(-30℃),停留一段時間(1~3h)后投入液氮。

(4)逐級降溫后投入液氮,如:0℃——-10℃(5min)——-15℃(5min)——-23℃(5min)——-30℃(5min)——-40℃(5min)——-196℃(液氮)。

2.6 保存后的化凍

一般在37℃~40℃溫水中快速化凍。

2.7 活力鑒定

通常采用TTC法,也稱氯化三苯四液唑還原法。如果是單細(xì)胞或原生質(zhì)體,可以采用活性熒光素染色法,顯示活細(xì)胞,統(tǒng)計存活率。

2.8 再培養(yǎng)

觀察組織細(xì)胞恢復(fù)生物的速度,存活率,植株的再生能力。

2.9 遺傳性狀分析

植株形態(tài)特征,生長發(fā)育,染色體、同工酶譜及抗逆性等。

3 影響超低溫保存效果的因素

3.1 材料的特性

包括植物的基因型,抗凍性,器官、組織和細(xì)胞怕年齡、生理狀態(tài)等。這些因素對眧低溫保存效果有很大的影響,從而要求在整個保存處理過程中采取相應(yīng)的,符合其特性的各種適宜的措施。比如材料如果是含量有液胞小、含水量小的細(xì)胞(如莖尖分生組織等),可用用快速降溫冰凍方法。含液胞大、含水量高的細(xì)胞的則一般需要采用慢速降溫法律等等。

3.2 預(yù)處理

是為了使保存材料達(dá)到超低溫保存所要求的生理特性:增加細(xì)胞分裂與分化的同步化。減少細(xì)胞慛自由水的含量。增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒力。主要的方法有以下幾種。

3.2.1 細(xì)胞、組織繼代培養(yǎng)中,細(xì)胞分裂分化同步化調(diào)控。L.A.Withers等指出,有絲分裂前或稍后的細(xì)胞抗凍能力強(qiáng),處于這個時期的細(xì)胞在超低溫保存后存活率高。

3.2.2 預(yù)培養(yǎng):增加培養(yǎng)基中的糖濃度,提高滲透壓。或者在預(yù)處理培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍保存劑,如脫落酸、山梨醇、二甲亞砜等。

3.2.3 低溫鍛煉:一些植物如康乃馨、蘋果等的莖尖在液氮保存前經(jīng)過低溫鍛煉可以提高存活率。液氮罐

另外,有些報道中采用上述幾種方法結(jié)合處理達(dá)到效果。

3.3 冰凍保護(hù)劑

作為冰凍保存劑的物質(zhì)需要具備發(fā)下特性:(1)易溶于水。(2)在適當(dāng)?shù)臐舛认聦?xì)胞是無毒的。(3)化凍后容易從組織細(xì)胞中少清除。常用的冰凍保護(hù)劑有二甲基亞砜、甘油、糖的糖醇為物質(zhì)等。

3.4 降溫冰凍方法

材料經(jīng)冰凍保護(hù)劑在0℃預(yù)處理30~40min后,要立即降溫冰凍,最后到達(dá)液氮中保存,降溫方法是影響超低溫保存效果的關(guān)鍵因素之一,所以它在超低溫保存技術(shù)體系中一直是注意較多的一個方面。一般根據(jù)不肉中刺的保存對象有四種不同的降溫就去:快速冰凍法、慢速冰凍法、兩步冰凍法、逐級冰凍法。

3.5 化凍方法

大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,植物的凍害常常是發(fā)生在冰凍和化凍兩個過程中,因此除了需要有一個合適的降溫冰凍程序外,還要有一個合適的化凍方法,以避免在化凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰。并防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細(xì)胞膜體系的在破壞。一般采用快速化凍法。即將液氮保存后的材料在37-40℃的溫水浴中化凍。因數(shù)超低溫冰凍材料化凍時,再次結(jié)冰的危險區(qū)域是-50℃~10℃.從理論上講可以借助迅速的化凍速度通過此溫度區(qū),從而可以避免細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰。但是如果材料是木本科和冬芽,那么在超低溫保存后必須在0℃低溫下進(jìn)行慢速化凍才能達(dá)到良好效果,因?yàn)槎恳呀?jīng)經(jīng)過低溫鍛煉,細(xì)胞內(nèi)的水分已經(jīng)在限度地流到細(xì)胞外結(jié)冰,快速化凍時會受到猛烈的滲透沖擊,從而會導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞,因此需要慢速解凍

4、在果樹質(zhì)資源保存中的應(yīng)用

4.1 花粉

最早在1922年,H.E.Knowlton就已經(jīng)在金魚草花粉方面取得了一害的成功。他把金魚草花粉冷凍到-180℃后,仍然獲得了一定程度的花粉的超低溫成功保存已有許多報道。已經(jīng)取得成功的有桃、李、木瓜、棗椰、鱷梨、胡桃等許多樹種。日本的Yatabe果樹試驗(yàn)站利用超低溫保存技術(shù)已經(jīng)保存了桃的60個栽培品種和品系的花粉,時間已達(dá)十年以上。

4.2 種子

種子在-18℃,含水量(5+1)%的情況下其新陳代謝仍然發(fā)生,導(dǎo)致生活力衰退。特別是執(zhí)拗型種子的壽命更短,難以保存。超低溫保存技術(shù)可以克服這些不利因素,使種子保存更為長久。目前果樹方面利用超低溫保存種子有檸檬、海棠等。

4.3 枝條、芽及莖尖分生組織

由于莖尖分生組織細(xì)胞分化程度小,倍性一致辭,遺傳上比較穩(wěn)定,且在離體條件下容易再生新植株,因此,莖尖的種質(zhì)保存意義重大。枝條、芽也是保存無性繁殖植物種質(zhì)的方便途徑。1978年日本學(xué)者就已報道了蘋果、梨、醋栗等果樹冬芽超低溫保存的成功。此后在蘋果、草莓等果樹莖尖保存中也取得了成功。

4.4 幼胚及胚狀體

單倍體細(xì)胞在遺傳上是不穩(wěn)定的,超低溫保存將是保持單倍體穩(wěn)定性的有效途徑。據(jù)Y.P.S.Bajiaj報道,柑桔的珠心胚經(jīng)過液氮保存后存活率為24%~28%。

4.5 組織及細(xì)胞

愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的超低溫保存也是果樹種質(zhì)資源保存的一個有途徑。在酸櫻桃、甘蔗、草莓等的愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的超低溫保存方面取得成功。

4.6 原生質(zhì)體

原生質(zhì)體具有多種用途,特別是在開辟果樹育種方面有著廣闊的前景,它是進(jìn)行細(xì)胞雜交和基因工程的基礎(chǔ)材料。對原生質(zhì)體的超低溫保存有著更大的優(yōu)越性:與具有細(xì)胞壁的細(xì)胞相比,它降低了冰凍的危害,能得到更高的存活率。但是原生質(zhì)體的超低溫保存要求較高,果樹原生質(zhì)體的超低溫保存報道較少。馬峰旺等(1998)報道,杏的一些品種的懸浮培養(yǎng)物分離的原生質(zhì)體超低溫保存后成活率可達(dá)40%。液氮罐

超低溫保存技術(shù)在種質(zhì)資源保存方面已經(jīng)取得了很大的成就,相信隨著超低溫技術(shù)的發(fā)展,在這一方面的應(yīng)用會愈加成熟,這一技術(shù)也必將為保持地球生態(tài)多樣性作出更大的項獻(xiàn)。
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